Por Lara Oliveira Clemente, 2016.
A demanda científica por ferramentas que fossem capazes de auxiliar na detecção e compreensão de polimorfismos genéticos culminou no surgimento, dentre outras ferramentas, dos Marcadores Moleculares (MM). Os MM podem ser definidos como características presentes no DNA e que podem ser usadas na diferenciação de dois ou mais indivíduos, além de serem heranças genéticas.
A análise molecular, ou o uso de MM, oferece vantagens sobre os convencionais marcadores morfológicos, pois, contornam as resultantes fenotípicas e podem ser encontrados em tecidos em diferente fases de desenvolvimento. Dentre as possíveis aplicações dos MM estão: identificação de genes de resistência a doenças, insetos e pragas; testes de pureza genética; desenvolvimento de mapas genéticos; e etc.
No universo da pesquisa genética e áreas relacionadas, a obtenção de uma metodologia que permitisse a síntese do DNA in vitro sempre foi essencial. Na década de 60 muitos cientistas já haviam se engajado nessa busca, um dos pioneiros foi Arthur Kornberg, pesquisador que se dedicou ao estudo da DNA polimerase. Já em 1983, Kary Mullis, pesquisador pela Cetus Corporation nos EUA, idealizou uma maneira de direcionar o trabalho da DNA polimerase, fazendo com que a mesma iniciasse e terminasse a duplicação da molécula de DNA em um trecho pré-determinado. A técnica idealizada por Mullis foi aperfeiçoada e apresentada em 1985, recebendo o nome de PCR (polymerase chain reaction).
O processo da PCR, que é relativamente simples, consiste na adição de amostras de DNA em um tubo de ensaio, juntamente com a DNA polimerase, precursores de síntese de DNA (dNTPs) e dois primers de DNA ou RNA. Os primers têm a função de ‘marcar’ onde a DNA polimerase inicia e termina em seu trabalho em cada uma das fitas, ou seja, delimitar o trecho a ser replicado; a distância entre os dois primers não pode ser muito grande, limitando-se no primeiro teste da PCR a um número de 1000 pb (pares de base).
No caso do RAPD (“Polimorfismo do DNA Amplificado ao Acaso” – “Random Amplified Polymorphism DNA”), ou AP-PCR (“Polimorfismo Amplificado pela Reação em Cadeia da Polimerase” – “Amplified Polymorphism – Polymerase Chain Reaction”), um dos primeiros marcadores moleculares baseados em PCR, seu embasamento se dá na amplificação do DNA sem a necessidade de conhecer previamente a sequência do DNA- alvo, dispensando também a escolha de sondas. Ou seja, marcadores RAPD não demandam primers espécie específicos. Os marcadores RAPD apresentam outras vantagens, a saber: dispensa uso de digestão com enzimas de restrição; pode ser realizado com uma quantidade menor de DNA; observação pode ser realizada diretamente no gel de eletroforese.
Portanto, os marcadores RAPD são eficientes pois tem ampla aplicabilidade, funcionam sob um protocolo simples e rápido em comparação com outros marcadores, como o RFLP. Além de serem funcionais na identificação de diferenças mínimas em espécies próximas, ou mesmo clones, devido ao grande número de marcadores que podem ser obtidos conforme aumenta-se o número de primers. Em decorrência desse fato, os RAPD são eficientes em estudos visando espécies raras, espécies ameaçadas, populações pequenas ou àquelas que se reproduzem predominantemente por auto-fecundação.
Contudo, esses marcadores são tidos como “dominantes”, ou seja, é incapaz de diferencias organismos homozigotos dominantes e heterozigotos para um mesmo loco, pois os dois casos irão resultar na visualização de apenas uma banda no gel. Logo, o polimorfismo evidenciado pelo uso dos RAPD é referente apenas a um loco, correspondente à banda visualizada em gel.
Referências consultadas:
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3.ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1998. p.220. (EMBRAPA-CENARGEN. Documentos, 20).
LACERDA, D. R. et al. A técnica de RAPD: uma ferramenta molecular em estudos de conservação de plantas. Lundiana, v.3, n.2, p.87-92, 2002.
WELSH, J.; McCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, v.18, p.7213-7218, 1990.
WILLIAMS, J.G.K.; KUBELIC, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY, S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, v.18, p.6531-6535, 1990.
